用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統及其應用

專利類型

發明

專利國別 (專利申請國家)

中華民國

專利申請案號

098135114

專利證號

I 393779

專利獲證名稱

用於哺乳動物細胞的三元件基因表現報導系統及其應用

專利所屬機關 (申請機關)

國立中正大學

獲證日期

2013/04/21

技術說明

我們建立了一個可在哺乳類活細胞中即時觀察去氧核醣核酸甲基化的增加和移除的二元件報告基因系統。設計當中的兩個元件分別為兩個質體去氧核醣核酸，用以模擬細胞中對位性基因型修飾調控基因轉錄的生理現象。第一個調控元件上含有研究者欲觀察之特定基因啟動子，此啟動子負責調控該元件上四環黴素抑制子的表現；第二個質體元件上則是含有一個可被哺乳類細胞使用的啟動子，及其後緊接的四環黴素操作子，該啟動子可用於促進下游一個報告基因（綠螢光蛋白或是冷光蛋白酶）的表現，而四環黴素操作子則可與四環黴素抑制子的雙體結合，阻礙啟動子對報告基因的調控，達到抑制基因轉錄的效果。當第一個元件的啟動子呈活化狀態時，會促進四環黴素抑制子的表現，阻礙第二個元件的啟動子功能，進而默化報告基因的表現；反之，當第一個元件的啟動子受到去氧核醣核酸甲基化修飾的調控而失去活性時，四環黴素抑制子將不表現，使第二個元件的啟動子能夠促進報告基因的表現。 本項專利之設計亦可用於簡便的藥物篩檢。透過建立基因背景較為一致的穩定細胞株，更可以在活細胞當中直接觀察報告基因的表達，而報告基因的表達程度直接展現了欲檢測基因啟動子之去氧核醣核酸甲基化修飾的調控改變，故在不破壞細胞的情形之下即可大量、快速的初步篩選有功能之去去氧核醣核酸甲基化之藥物，節省篩選時間，以利更進一步的檢測，而達新藥之開發。 A real-time visualization system is developed to monitor the occurrence and removal of DNA methylation in live cells. Targeted DNA methylation strategy (previous invention, patent pending) was combined with a two-component reporter system in order to establish a monitoring system for the dynamic nature of DNA methylation changes in vivo. The first component/plasmid contains the target promoter that regulates the expression of a downstream Tet repressor. The second plasmid is consisted of the Tet repressor operon and the downstream reporter genes. Both constructs were co-transfected into the mammalian cells and stable clones with both plasmids were isolated. After the methylation was induced at the target promoter, the silencing of the Tet repressor released the inhibition of the reporter genes. This system is efficient in studying the molecular events that trigger DNA methylation and in screening new drugs that cause DNA demethylation.

備註

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