鑑定企鵝科鳥類性別的方法、鑑別企鵝科鳥類性別之核苷酸序列與鑑別企鵝科鳥類性別之核苷酸引子對

專利類型

發明

專利國別 (專利申請國家)

中華民國

專利申請案號

100140656

專利證號

I 524067

專利獲證名稱

鑑定企鵝科鳥類性別的方法、鑑別企鵝科鳥類性別之核苷酸序列與鑑別企鵝科鳥類性別之核苷酸引子對

專利所屬機關 (申請機關)

高雄醫學大學

獲證日期

2016/03/01

技術說明

性別是監測族群穩定的重要因素，但是大部分企鵝很少有清楚的雌雄二型性(sexual dimorphism)，因此很難辨識出他們的性別。本專利的目的是針對巴布亞企鵝 (Pygoscelis papua)、小藍企鵝(Spheniscus magellanicus)、跳岩企鵝(Eudyptes chrysocome)和國王企鵝(Aptenodytes patagonicus)等建立高通量的性別鑑定方法。我們發現在巴布亞企鵝中，使用染色體解旋酶DNA結合蛋白(CHD)的Griffiths P2/P8引子擴增產物，無法在解離曲線分析(melting curve analysis; MCA)中，產生可區分性別的解離曲線。因此，傳統的P2/P8引子在這兩種物種不適合高通量的應用。將這四種物種的CHD-W/CHD-Z基因的序列進行對齊排列，我們重新設計2個雌性特有的CHD-W基因引子(PGU-W1與PGU-W2)和雌、雄性(或CHD-W/CHD-Z基因)的共同引子(PGU-ZW1與PGU-ZW2)，分別與Griffiths的P2引子結合，進行同步化PCR的解離曲線分析。以巴布亞企鵝為例，使用引子對PGU-W1/P2與PGU-ZW1/P2進行PCR的擴增長度分別為287-和126-bp，而使用引子對PGU-W2/P2與PGU-ZW2/P2進行PCR的擴增長度則分別為356-和148-bp。引子對PGU-W1/P2與PGU-ZW1/P2進行PCR的解離溫度(Tm)範圍為分別為81.5 ℃及79.5~80.0 ℃；同樣地，引子對PGU-W2/P2與PGU-ZW2/P2進行PCR的解離溫度(Tm)範圍分別為81.0~81.5 ℃及79.5~80.5 ℃。因此，使用我們設計的兩組引子對進行解離曲線分析，均可發現雌性有兩個不同的解離溫度高峰(Tm)；可區別於雄性只產生一個高峰。所以，利用我們重新設計的引子去做real time PCR的解離曲線分析，可以提供巴布亞企鵝、小藍企鵝、跳岩企鵝和國王鵝的高通量性別鑑定方法。 We redesigned two female-specific CHD-W primers (PGU-W1 and PGU-W2) and two female/male (or CHD-W/CHD-Z)-common primers (PGU-ZW1 and PGU-ZW2) to combine with the Griffiths P2 primer to generate two PCR amplicons with different lengths. In the example of P. papua, the lengths of the amplicons for PGU-W1/P2 and PGU-ZW1/P2 are 287- and 126-bp and for PGU-W2/P2 and PGU-ZW2/P2 are 356- and 148-bp, respectively. Melting temperature (Tm) values for PGU-W1/P2 and PGU-ZW1/P2 amplicons were determined and resolved in MCA at approximately 81.5 and 79.5~80.0 oC, respectively. Similarly, melting temperature (Tm) values for PGU-W2/P2 and PGU-ZW2/P2 amplicons were determined and resolved in MCA at approximately 81.0~81.5 and 79.5~80.5 oC, respectively. Accordingly, females contained two Tm peaks, whereas males contained one. In conclusion, melting curve analysis (MCA) using our proposed primer sets was a robust gender identification method for the four P. papua tested.

備註

連絡單位 (專責單位/部門名稱)

智財保護與科技管理組

連絡電話

07-3138030

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