細菌基因編輯方法

專利類型

發明

專利國別 (專利申請國家)

大陸

專利申請案號

201610919263.1

專利證號

3937305

專利獲證名稱

細菌基因編輯方法

專利所屬機關 (申請機關)

國立清華大學

獲證日期

2020/08/14

技術說明

CRISPR/Cas9系統是利用小片段的RNA以及Cas9蛋白來辨認特定的核甘酸序列，造成目標基因的斷裂，目前已廣泛應用於哺乳類細胞之基因編輯(genome editing)，但在微生物代謝工程上應用較為少見。由於目前於大腸桿菌(E. coli)之基因編輯系統仍有諸多的缺點與限制，因此本專利主旨是希望在前述菌類中建立CRISPR/Cas9的基因編輯系統平台，藉此來增進基因剪輯之效率。於大腸桿菌的基因編輯優化中(以MG1655為例)，在不同大小的模板的條件下(1.4-7.0 kb)，本專利成功利用CRISPR/Cas9系統將同源重組效率提昇至8-23倍(相較於對照組)，特別是當模板長度高於5.4 kb時，挑選到正確菌落的機率可由<1%提升至45-50%。本專利目前也證實當模板長度高達7.0 kb時，仍有良好的重組效率以及正確率。對於其他不同類型的大腸桿菌品系(BL21 (DE3)及W)，皆展現促進同源重組的效用。 Here we hypothesized that CRISPR/Cas9-triggered DSB could enhance homologous recombination and augment integration of large DNA into E. coli chromosome. We demonstrated that CRISPR/Cas9 system was able to trigger DSB in >98% of cells, leading to subsequent cell death, and identified that mutagenic SOS response played roles in the cell survival. By optimizing experimental conditions and combining the -Red proteins and linear dsDNA, CRISPR/Cas9-induced DSB enabled homologous recombination of the donor DNA and replacement of lacZ gene in the MG1655 strain at efficiencies up to 99%, and allowed high fidelity, scarless integration of 2.4, 3.9, 5.4 and 7.0 kb DNA at efficiencies approaching 91%, 92%, 71% and 61%, respectively.

備註

本案為執行科技部產學大聯盟計畫產出，依據共有協議書之規範，專利權比例分配如下： 國立清華大學65.22% 長春人造樹脂廠股份有限公司21.74% 長春石油化學股份有限公司13.04%

連絡單位 (專責單位/部門名稱)

智財技轉組

連絡電話

03-5715131-62219

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