鑑定番茄斑點萎凋病毒屬(Tospovirus genus)之西瓜銀斑病毒血清群病毒(WSMoV-serogroup tospoviruses)之單株抗體及其製備方法與應用

專利類型

發明

專利國別 (專利申請國家)

中華民國

專利申請案號

0095144871

專利證號

I301853

專利獲證名稱

鑑定番茄斑點萎凋病毒屬(Tospovirus genus)之西瓜銀斑病毒血清群病毒(WSMoV-serogroup tospoviruses)之單株抗體及其製備方法與應用

專利所屬機關 (申請機關)

國立中興大學

獲證日期

2008/10/11

技術說明

WSMoV為台灣瓜類作物栽培的主要限制因子之一，其全長度基因體已由本實驗室解序完成。除了核鞘蛋白之外，此病毒之其他蛋白皆難於自罹病組織中純化，故利用基因選殖方法將其非結構性NSs蛋白基因增幅出來，再構築於由本研究室所研發之矮南瓜黃化嵌紋病毒載體 (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV) 的P1和HC-Pro 基因之間，所表現的NSs蛋白C端具有六個histidine胺基酸所構成的標誌 (his-tag) 與一個NIa蛋白裂解酶的辨識序列，有助於表現蛋白的游離與純化。利用Ni2+-NTA親和性管柱將游離態的NSs蛋白純化出來，再以蛋白電泳進一步分離純化之，即可得到高純度的NSs蛋白。將所得的NSs蛋白免疫注射於紐西蘭白兔與小白鼠體內，分別用以製備抗血清及單株抗體。抗血清與WSMoV血清群中的WSMoV反應良好，與彩色甜椒黃化病毒 (Capsicum chlorosis virus, CaCV) 有微弱的反應，而與彩色海芋黃化斑點病毒 (Calla lily chlorotic spot virus, CCSV) 則無任何血清反應。反之，單株抗體則與WSMoV、CaCV及CCSV皆反應良好。利用ZYMV載體表現一系列的缺失NSs蛋白可得知第89-125個胺基酸的區域為單株抗體的辨識位置，其中第108個cysteine (C) 和第109個lysine (K) 扮演重要的角色。序列比對後發現，此單株抗體辨識區域具有一段高度保留的序列，即位於NSs蛋白第98-120個胺基酸的位置，序列為VRKPGVKNTGCKFTMHNQIFNPN (命名為WNSscon)，分別與WSMoV、CaCV、CCSV和花生頂芽壞疽病毒 (Peanut bud necrosis virus, PBNV) 具有86-100%的相同度。以人工合成此高保留性區域可與單株抗體反應良好，證實此高保留性區域確實含有單株抗體的結合序列。由此可知，本發明之單株抗體具有高度的親緣專一性，可與WSMoV血清群之病毒反應良好，而NSs蛋白為植物防禦反應基因沉寂的抑制子，亦具有研究植物防禦反應與病毒間交互關係之學術價值。 Using the plant viral vector, the NSs protein of WSMoV was expressed for production of serogroup-specific monoclonal antibodies. The monoclonal antibodies become a useful tool for prevention and quarantine of WSMoV-serogroup tospoviruses. On the other hand, the NSs protein is a gene-silencing suppressor to overcome plant defense, the monoclonal antibodies are also valuable for studying the relationships of plant and virus interactions.

備註

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