鑑定鳩鴿科鳥類性別的方法、鑑別鳩鴿科鳥類性別之核苷酸序列與鑑別鳩鴿科鳥類性別之核苷酸引子對

專利類型

發明

專利國別 (專利申請國家)

中華民國

專利申請案號

099109810

專利證號

I 472623

專利獲證名稱

鑑定鳩鴿科鳥類性別的方法、鑑別鳩鴿科鳥類性別之核苷酸序列與鑑別鳩鴿科鳥類性別之核苷酸引子對

專利所屬機關 (申請機關)

高雄醫學大學

獲證日期

2015/02/11

技術說明

因為外表無法區分性別，所以大多數的鳩鴿科鳥類屬於單一性徵。現在的決定鳩鴿科的性別技術主要是取決於聚合酶連鎖反應(PCR)並配合電泳分析，但是有無法進行高通量分析與耗費勞力的缺點。 因此，我們提出無需電泳的方法，即熔點曲線分析(melting curve analysis; MCA)來執行三種鳩鴿科- 家鴿、灰林鴿與紅鳩(Columba livia, Columba pulchricollis, and Streptopelia tranquebarica)的高通量性別分析。雖然以染色體解旋酶DNA鍵結蛋白質(Chromo-Helicase-DNA binding protein; CHD)為基礎的Griffiths P2/P8引子對(primer set)可以利用3%凝膠電泳分析P2/P8的PCR產物，將CHD-Z與CHD-W基因分辨出來(母鳥同時具有CHD-Z與CHD-W；而公鳥只有兩對CHD-Z)，但是卻無法使用熔點曲線分析分辨出來而無法進行鳩鴿科的高通量性別鑑定。經過CHD-Z與CHD-W的基因定序後，我們重新設計出雌性專一的CHD-W 引子(dove-W)與雌雄共通的(CHD-Z/CHD-W-common) 引子(dove-ZW)分別作為reverse引子，去結合Griffiths P2引子(作為forward primer)已產生兩種不同長度的PCR產物(即P2/dove-W與 P2/dove-ZW PCR可分別得到104- and 252-bp)。利用P2/dove-W and P2/dove-ZW兩者PCR產物的熔點值(melting temperature; Tm)分析，發現可以分別在79.0~79.5oC與 77.5oC區分出來。因此，熔點曲線分析法可以用於受測試的三種鳩鴿科的高通量性別分析，並且其他物種若使用重新設計的引子將有潛力的提供類似的應用。 Most Columbidae species (Pigeons and doves) belong to sexually monomorphic birds due to their undistinguished external morphology. Here, we propose an electrophoresis-free method, called melting curve analysis (MCA), to perform the robust gender identification of three different Columbidae species (Columba livia, Columba pulchricollis, and Streptopelia tranquebarica). After sequencing the CHD-Z and CHD-W genes for these species, we had re-designed a female-specific CHD-W primer (dove-W) and a female/male (or CHD-Z/CHD-W)-common primer (dove-ZW) to combine with Griffiths P2 primer to generate two PCR amplicons with different length (P2/dove-W and P2/dove-ZW for 104- and 252-bp, respectively). The melting temperature (Tm) values for P2/dove-W and P2/dove-ZW amplicons are determined and resolved in MCA about 79.0~79.5oC and 77.5oC, respectively. Therefore, MCA is a robust gender identification method for tested Columbidae species.

備註

本部(發文號1100044017)同意貴校110年1月28日高醫產學字第1101100305號函申請終止維護專利。(高醫)

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