真核生物表現系統及其應用EUKARYOTIC EXPRESSION SYSTEM AND USE THEREOF

專利類型

發明

專利國別 (專利申請國家)

中華民國

專利申請案號

102128443

專利證號

I 504747

專利獲證名稱

真核生物表現系統及其應用EUKARYOTIC EXPRESSION SYSTEM AND USE THEREOF

專利所屬機關 (申請機關)

國立中興大學

獲證日期

2015/10/21

技術說明

我們已製備針對西瓜銀斑病毒（WSMoV）非結構蛋白(Nonstructural protein, NSs)的單株抗體(NSscon MAb)，具有極高的專一性與靈敏度，可用於廣泛偵測番茄斑萎病毒之亞洲型病毒。其共同的抗原決定基NSscon，是一長度為23個胺基酸的高度保留區域。在本次研究中，我們利用細菌系統表現的水母綠色螢光蛋白（GFP）連結不同片段長度的NSscon片段，來決定其抗原決定基的最短片段。我們的研究結果顯示，NSscon上九個氨基酸，“109KFTMHNQIF117”， 是保留與單株抗體反應性的最短片段，將其命名為“nss”。我們先在細菌表現系統中測試nss-tag的應用性。四個不同的重組蛋白分別被nss-tag標記在蛋白的N端或C端，其蛋白表現皆可以被NSscon MAb檢測到，靈敏度比聚組氨酸標記(6x his-tag)優異且nss-tag的位置效應較不明顯。我們也證明nss-tag可被應用於偵測由矮南瓜黃化嵌紋病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)載體在矮南瓜上表現的重組蛋白。nss-tag 可被用於西方轉漬法或是酵素免疫連結法來偵測蛋白。當nss-tag標定ZYMV的協同蛋白酶（HC-Pro）和WSMoV核鞘蛋白(NP)，以農桿菌注射法於煙草葉片上分析基因沉寂抑制子的活性。被標定的重組蛋白可被檢測到，且nss-tag並不影響被標定蛋白的功能。我們亦利用ZYMV之協同蛋白與鞘蛋白之交互作用關係來證明nss-tag可被用於蛋白質的共同免疫沉降實驗。因此，由我們所發展新的nss-tag標定系統，應用在細菌和植物表達系統是非常有價值的。 We expressed different green fluorescent protein-fused deletions of NSscon in bacteria and reacted with NSscon monoclonal antibody. The core 9 amino acids, “109KFTMHNQIF117”, denoted as “nss”, retain the reactivity of NSscon. In bacterial pET system, four different recombinant proteins labeled with nss, either at N- or C-extremes, were readily detectable, with sensitivity superior than that for the polyhistidine-tag and less position effects. Immunobloting and indirect ELISA revealed the feasibility of nss sequence for tagging three recombinant proteins expressed by a ZYMV vector in squash plants. When the nss-tagged ZYMV HC-Pro and WSMoV nucleocapsid protein transiently were expressed by agroinfiltration into tobacco, they were readily detectable and the tag’s possible efficacy for gene silencing suppression was not noticed. Co-immunoprecipitation of nss-tagged and non-tagged proteins expressed from bacteria confirmed the interaction of potyviral HC-Pro and coat protein.

備註

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